Desenvolvimento de RT multiplex quantitativo

Scientific Reports volume 13, Artigo número: 12073 (2023) Citar este artigo

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A hepatite Delta é uma doença causada pela exposição aos vírus da hepatite B (HBV) e da hepatite D (HDV), geralmente com evolução clínica mais grave quando comparada a uma monoinfecção pelo HBV. Até à data, a prevalência real da infecção pelo VHD está subestimada e os métodos de detecção estão pouco disponíveis, especialmente em regiões mais endémicas. Portanto, foi desenvolvido um método RT-qPCR de uma etapa para quantificação de RNA-HDV. Amostras biológicas foram selecionadas entre 2017 e 2023 de pacientes do Ambulatório Especializado em Hepatites Virais do Centro de Pesquisa em Medicina Tropical de Rondônia e Serviço de Assistência Especializada e foram submetidas ao teste desenvolvido por este estudo e a um segundo ensaio quantitativo de RT-qPCR. A inclinação do ensaio quantitativo inicial foi de -3,321 com eficiência de 100,04% e fator de amplificação igual a 2. A análise dos dados de repetibilidade revelou Limite de Quantificação de 5 cópias/reação e Limite de Detecção (95%) de 2,83 cópias por reação. reação. Nos testes de sensibilidade diagnóstica houve acurácia de 97,37% quando comparado ao teste de referência. Este ensaio provou ser altamente eficiente e reprodutível, tornando-se uma ferramenta valiosa para monitorar pacientes com hepatite Delta e avaliar o risco de progressão da doença, bem como a eficácia do tratamento.

O vírus da hepatite delta (HDV) classificado no gênero Deltavirus é atípico, apresentando cerca de 1.700 nucleotídeos de uma fita simples de RNA de polaridade negativa com tamanho entre 36 e 43 nm e em sua estrutura externa apresenta proteínas de superfície do vírus da hepatite B (HBV). )1,2. A infecção pelo HDV é precedida por exposição prévia, infecção atual ou simultânea pelo HBV. Geralmente seu desfecho clínico será mais grave, caracterizado por progressão acelerada para cirrose ou carcinoma hepatocelular quando comparado à monoinfecção pelo VHB3,4,5.

Atualmente é difícil estimar com precisão a prevalência do HDV em todo o mundo; pelo menos 12 a 15 milhões de pessoas podem estar infectadas com o vírus, distribuídas por África, Ásia, Américas, Mediterrâneo Oriental e Europa6,7. Na América do Sul, a área endêmica para HDV está localizada no norte (região da bacia amazônica) e abrange vários países5,8,9,10. No Brasil, entre 2000 e 2021, o número de casos notificados foi de 4.259. Esses números podem ser considerados subnotificados, uma vez que esta doença permanece negligenciada em todo o país e não há busca ativa de pacientes monoinfectados pelo VHB para determinar coinfecções11.

O diagnóstico sorológico da infecção por HDV é baseado na detecção de anticorpos totais anti-HDV no soro. A presença de HDAg no tecido hepático também é um indicador clínico que permite a confirmação da infecção através da elastografia hepática, método não invasivo e indolor que permite avaliar o grau de fibrose hepática4,12. Uma vez detectados anticorpos anti-HDV, o diagnóstico molecular é usado para confirmar ou descartar infecção ativa. O teste molecular é realizado por meio da busca de RNA do HDV no plasma, quantificado pelo método RT-qPCR; porém, isso não é convencional, pois não há kits registrados na Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Anvisa). A utilização de métodos moleculares para quantificação do HDV em áreas restritas onde profissionais especializados podem desenvolver testes internos também é um fator limitante13.

Portanto, o diagnóstico molecular do HDV permanece um desafio porque não está amplamente disponível para áreas endêmicas na região amazônica. O objetivo do estudo foi desenvolver um ensaio RT-qPCR multiplex quantitativo de alta sensibilidade em uma etapa para o diagnóstico e acompanhamento de pacientes com Hepatite Delta.

O plasmídeo foi testado em intervalos de 1 × 105 e 1,25 cópias por reação (1 × 105, 1 × 104, 1 × 103, 1 × 102, 1 × 101, 5, 2,5 e 1,25), para determinar a eficiência e linearidade da amplificação. Todos os pontos da curva de quantificação acima de 5 cópias por reação tiveram 100% de amplificação nos diferentes ensaios. A inclinação do teste quantitativo inicial foi de -3,321 com eficiência de 100,04%, coeficiente de correlação da linha reta (R2) igual a 0,99 e fator de amplificação igual a 2 (ver Figura 1).